激光(guāng)共聚焦掃(sǎo)描顯微鏡(jìng)簡介(jiè)

一， 激(jī)光(guāng)共聚(jù)焦顯(xiǎn)微鏡的基(jī)本組成
  激(jī)光(guāng)掃描共(gòng)聚焦顯微(wēi)鏡(jìng)(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世(shì)紀80年(nián)代(dài)發展(zhǎn)起來的一項(xiàng)具(jù)有劃(huá)時代(dài)意(yì)義的高科(kē)技新產品，是當今(jīn)世界(jiè)*先進的細(xì)胞(bāo)生物(wù)學分(fēn)析(xī)儀器。激(jī)光共(gòng)聚焦顯微鏡利用激光作(zuò)為光(guāng)源(yuán)，在(zài)傳統光學顯微鏡基礎上(shàng)采(cǎi)用(yòng)共(gòng)軛(è)聚焦的原理(lǐ)和(hé)裝置，以及(jí)通過針孔的(dí)選(xuǎn)擇和(hé)PMT的(dí)收集，並帶有(yǒu)一(yī)套(tào)對其所(suǒ)觀(guān)察到(dào)的(dí)對(duì)象進(jìn)行(háng)數字(zì)圖(tú)像(xiàng)分析(xī)處理(lǐ)的係統(tǒng)軟件。與(yǔ)傳統(tǒng)光學顯(xiǎn)微(wēi)鏡相比(bǐ)，它具有更高(gāo)的分辨率，實現(xiàn)多(duō)重熒(yíng)光的(dí)同(tóng)時(shí)觀(guān)察並可形成清晰的(dí)三維(wéi)圖(tú)象(xiàng)等優點(diǎn)。所(suǒ)以它(tā)問世(shì)以(yǐ)來在(zài)生(shēng)物學的(dí)研(yán)究領域(yù)中(zhōng)得到了廣泛(fàn)應用(yòng)。
激(jī)光(guāng)共聚焦顯(xiǎn)微鏡主(zhǔ)要(yào)有(yǒu)四(sì)部(bù)分組(zǔ)成
：1，顯微鏡光學係(xì)統。2，掃(sǎo)描(miáo)裝(zhuāng)置。3，激(jī)光光(guāng)源。4，檢測(cè)係統。整(zhěng)套儀器由計算(suàn)機控製(zhì)，各(gè)部(bù)件(jiàn)之間的(dí)操作切換(huàn)都可(kě)在計(jì)算機操作平台(tái)界麵中(zhōng)方(fāng)便靈活地進(jìn)行。
1.1 顯微(wēi)鏡光學(xué)係統
　　顯(xiǎn)微(wēi)鏡是(shì)LSCM的主(zhǔ)要(yào)組件(jiàn)，它關係(xì)到(dào)係統(tǒng)的成象(xiàng)質(zhì)量。顯微鏡光(guāng)路以無(wú)限(xiàn)遠光學(xué)係(xì)統可方(fāng)便地在(zài)其(qí)中(zhōng)插人光學選件(jiàn)而不影響成象質量(liáng)和測量(liáng)精(jīng)度。物(wù)鏡應選(xuǎn)取大數(shù)值(zhí)孔(kǒng)徑平場(cháng)復(fù)消色(sè) 差(chà)物(wù)鏡，有利於熒(yíng)光(guāng)的采集(jí)和成象的(dí)清晰(xī)。物(wù)鏡(jìng)組(zǔ)的轉(zhuǎn)換，濾色片(piàn)組的選取，載(zǎi)物(wù)台的移(yí)動調(tiáo)節(jié)，焦平麵的記憶鎖(suǒ)定都應(yīng)由計算(suàn)機自動(dòng)控製。
1.2 掃描(miáo)裝置(zhì)
　　LSCM使用(yòng)的(dí)掃(sǎo)描裝置(zhì)在(zài)生物領域(yù)一(yī)般為(wéi)鏡(jìng)掃描(miáo)。由(yóu)於轉(zhuǎn)鏡隻(zhī)需偏(piān)轉(zhuǎn)很小(xiǎo)角(jiǎo)度就能涉及(jí)很大(dà)的掃描範(fàn)圍，圖象采集速度大大提(tí)高(gāo)，512×512畫(huà)麵(miàn)每秒可達4幀以(yǐ)上，有利(lì)於那些(xiē)壽(shòu)命短(duǎn)的離(lí)子(zǐ)作(zuò)熒光(guāng)測(cè)定。掃描係(xì)統(tǒng)的工(gōng)作程序(xù)由計算機自動控(kòng)製。
1.3 激光(guāng)光(guāng)源
　　LSCM使用的(dí)激(jī)光光源(yuán)有(yǒu)單(dān)激光和多激(jī)光係(xì)統。多(duō)激光(guāng)器係(xì)統(tǒng)在(zài)可見光(guāng)範(fàn)圍使用多(duō)譜綫氬離子激光器，發(fā)射波長(cháng)為(wéi)457nm，488nm和514nm的(dí)藍綠(lǜ)光，氦氖綠激光器提供發(fā)射波(bō)長為543nm的(dí)綠(lǜ)光(guāng)，氦氖紅激(jī)光器發射波長為633nm的(dí)紅(hóng)光，新(xīn)的405nm半導體激(jī)光(guāng)器(qì)的(dí)出現(xiàn)可以提(tí)供近紫(zǐ)外譜綫，但是小(xiǎo)巧便(biàn)宜而(ér)且(qiě)維護簡單。
1.4 檢測係(xì)統(tǒng)
　　LSCM為多通(tōng)道熒光(guāng)采集係統，一般有(yǒu)三個熒光通(tōng)道和一(yī)個透(tòu)射光(guāng)通道，能(néng)升級(jí)到四個熒光通道(dào)，可對物體進行多(duō)譜綫(xiàn)激(jī)光激(jī)發，樣品(pǐn)發(fā)射熒(yíng)光的探(tàn)測器為感光靈敏度(dù)高的(dí)光電倍增管PMT，配有高速12位A/D轉換(huàn)器，可(kě)以做光子計數(shù)。PMT前設(shè)置針(zhēn)孔，由(yóu)計(jì)算機軟件調節針孔大小(xiǎo)，光路(lù)中(zhōng)設有(yǒu)能(néng)自(zì)動切(qiē)換的(dí)濾(lǜ)色片(piàn)組，滿(mǎn)足不同測量(liáng)的需要,也(yě)有(yǒu)通過(guò)光柵或棱鏡分光後進行光(guāng)譜掃描功(gōng)能的設(shè)置。
二(èr)，激(jī)光共聚(jù)焦顯微鏡的特點(diǎn)以(yǐ)及在(zài)生(shēng)物領域的應(yīng)用(yòng)
傳(chuán)統光(guāng)學(xué)顯(xiǎn)微(wēi)鏡(jìng)相(xiāng)比(bǐ)，激光(guāng)共聚焦顯微(wēi)鏡具有(yǒu)更(gēng)高的分(fēn)辨率(shuài)，實現多重(zhòng)熒光的(dí)同時觀察並可(kě)形成清晰的三維圖象(xiàng)等優(yōu)點(diǎn)，在對生(shēng)物(wù)樣品的(dí)觀(guān)察中，激光共聚(jù)焦(jiāo)顯微鏡(jìng)有(yǒu)如(rú)下(xià)優越性(xìng)
：
1，對(duì)活(huó)細胞(bāo)和(hé)組(zǔ)織(zhī)或細(xì)胞切(qiē)片進(jìn)行連(lián)續掃(sǎo)描，可(kě)獲得精細的(dí)細胞骨架，染色(sè)體，細胞器和細(xì)胞膜係統的三(sān)維(wéi)圖(tú)像。
2，  可以得到(dào)比(bǐ)普(pǔ)通(tōng)熒(yíng)光(guāng)顯微鏡(jìng)更高對(duì)比(bǐ)度，高解(jiě)析(xī)度圖(tú)象，同時具有高靈敏度(dù)，傑出樣品(pǐn)保護(hù)。
3，多維圖象的(dí)獲(huò)得，如(rú)7 維(wéi)圖象(XYZaλIt): xyt ，xzt 和(hé)xt 掃描,時間(jiān)序列掃描(miáo)旋轉(zhuǎn)掃描，區域掃(sǎo)描，光譜(pǔ)掃描，同(tóng)時(shí)方便進行圖像(xiàng)處理。 
4，細胞(bāo)內(nèi)離子熒光(guāng)標(biāo)記，單標記(jì)或(huò)多標記，檢測(cè)細胞(bāo)內如PH和鈉，鈣(gài)，鎂(měi)等離(lí)子(zǐ)濃度(dù)的比(bǐ)率(shuài)測定及動態變(biàn)化(huà)。
5，熒光標記(jì)探(tàn)頭標記的(dí)活(huó)細(xì)胞或(huò)切片標本的(dí)活細胞生物(wù)物(wù)質，膜標記，**物質，**反應，受體或配(pèi)體(tǐ)，核酸等觀察(chá)；可以在同一(yī)張樣(yàng)品上進行同時多(duō)重(zhòng)物質(zhì)標記(jì)，同時觀(guān)察(chá)； 
6，對細胞檢測無損傷，**，準確(què)，可靠(kào)和優良(liáng)重復性；數(shù)據圖像(xiàng)可及時(shí)輸(shū)出或(huò)長(cháng)期儲(chǔ)存。 
   由於(yú)共聚焦(jiāo)顯微鏡的(dí)以上優(yōu)點，激光共(gòng)聚焦顯(xiǎn)微鏡在以下研究(jiū)領域中(zhōng)應(yīng)用較為廣(guǎng)泛
：
1，細(xì)胞(bāo)生(shēng)物學(xué)
：
如
：細胞(bāo)結構，細胞(bāo)骨架(jià)，細胞(bāo)膜結構(gòu)，流(liú)動(dòng)性，受體(tǐ)，細胞器(qì)結(jié)構(gòu)和(hé)分布(bù)變化，細(xì)胞(bāo)凋亡(wáng)機製；各種細(xì)胞(bāo)器，結(jié)構性(xìng)蛋(dàn)白(bái)，DNA，RNA，酶和(hé)受(shòu)體(tǐ)分(fēn)子(zǐ)等(děng)細(xì)胞特異性(xìng)結構的(dí)含(hán)量，組(zǔ)分(fēn)及(jí)分布進行定量分析；DNA，RNA含(hán)量，利(lì)用(yòng)特定(dìng)的(dí)抗體(tǐ)對(duì)紫外(wài)綫(xiàn)引(yǐn)起的DNA損(sǔn)傷(shāng)進(jìn)行觀察(chá)和定量(liáng)；分(fēn)析(xī)正(zhèng)常(cháng)細胞和癌(ái)細胞(bāo)細胞骨架與核(hé)改變(biàn)之(zhī)間的關(guān)係(xì)；細胞黏附(fù)行為(wéi)等(děng)   
2，生物(wù)化(huà)學
：
如
：酶(méi)，核(hé)酸(suān)，受體(tǐ)分析，熒光原位(wèi)雜交(jiāo)，雜色體(tǐ)基(jī)因(yīn)定(dìng)位等(děng)，利用共(gòng)聚(jù)焦技術可以取(qǔ)代傳統(tǒng)的核(hé)酸(suān)印跡染(rǎn)交等技術，進行(háng)基因(yīn)的(dí)表達(dá)檢(jiǎn)測，使基因的(dí)轉(zhuǎn)錄(lù)，翻(fān)譯等(děng)檢(jiǎn)測變的更加簡單，準確。
3，藥理學(xué)
：
如
：**對細胞(bāo)的作(zuò)用(yòng)及其動(dòng)力(lì)學；**進(jìn)入(rù)細胞的動態過(guò)程，定(dìng)位分布(bù)及定量 
4，生(shēng)理(lǐ)學，發育(yù)生物學
：
如
：膜受體(tǐ)，離子通道，離子含量(liáng)，分布，動態(tài)；動物發育(yù)以及胚胎(tāi)的形成(chéng)，骨(gǔ)髓(suǐ)幹細胞(bāo)的分化行為；細胞膜電(diàn)位的測量.熒光漂(piāo)白恢(huī)復(fù)（FRAP），熒光漂白丟失（FLIP）的測量等。 
5，遺(yí)傳學和組胚學
：
如
：細胞生(shēng)長(cháng)，分化，成(chéng)熟(shú)變化，細胞(bāo)的(dí)三維結構，染色體(tǐ)分析(xī)，基(jī)因表達(dá)，基(jī)因(yīn)診斷(duàn)； 
6，神(shén)經生物(wù)學
：
如(rú)
：神經(jīng)細胞結構，神(shén)經遞質的(dí)成分，運輸和(hé)傳遞(dì)； 
7，微生物(wù)學和寄生蟲(chóng)學
：
如
：**，寄(jì)生蟲形(xíng)態結(jié)構； 
8，病(bìng)理(lǐ)學及(jí)病理學臨(lín)床應用(yòng)
：
如(rú)
：活檢標本(běn)的快速診(zhěn)斷(duàn)，腫瘤診(zhěn)斷(duàn)，自(zì)身**性**的診斷(duàn)； 
9，**學(xué)，環(huán)境醫學和營養(yǎng)學。
如(rú)
：**熒光(guāng)標記（單標(biāo)，雙(shuāng)標(biāo)或三(sān)標）的定位(wèi)，細胞膜受體或抗原的分布,微(wēi)絲，微管的分(fēn)布(bù)，兩種或三種蛋白的共存(cún)與(yǔ)共定位(wèi)，蛋白與細(xì)胞(bāo)器的共(gòng)定位；對活(huó)細胞中的蛋(dàn)白質(zhì)進(jìn)行準確(què)定位(wèi)及動(dòng)態觀察可(kě)實(shí)時原位跟蹤(zōng)特(tè)定蛋(dàn)白(bái)在細(xì)胞生(shēng)長(cháng)，分裂，分化過程中的(dí)時(shí)空表(biǎo)達(dá)，熒(yíng)光能量共轉(zhuǎn)移（FRET）。