雙(shuāng)光(guāng)子共聚(jù)焦顯微(wēi)鏡

激光共(gòng)聚焦顯微(wēi)鏡在進(jìn)行生物(wù)樣品(pǐn)研究(jiū)工作中還存(cún)在很(hěn)多(duō)局(jú)限(xiàn)和(hé)問題：
一是標記染料的光(guāng)漂(piāo)白現象。因為(wéi)共焦(jiāo)孔(kǒng)徑光(guāng)闌必須足(zú)夠(gòu)小以(yǐ)獲得高分辨(biàn)率的圖像，而(ér)孔徑小又會(huì)擋(dǎng)掉很大(dà)部分從(cóng)樣(yàng)品發出的熒光，包括從(cóng)焦(jiāo)平麵發(fā)出的熒(yíng)光，相應(yīng)的(dí)，激(jī)發(fā)光(guāng)必(bì)須(xū)足夠(gòu)強以獲得足夠的信(xìn)噪比；而高(gāo)強度的(dí)激(jī)光會(huì)使(shǐ)熒(yíng)光染(rǎn)料在連(lián)續掃(sǎo)描過(guò)程(chéng)中(zhōng)迅(xùn)速(sù)褪色，熒光(guāng)信號(hào)會(huì)隨著掃(sǎo)描(miáo)進程(chéng)度進行(háng)變(biàn)得越來(lái)越(yuè)弱(ruò)。
光(guāng)毒作用(yòng)是(shì)另(lìng)外一(yī)個問題，在(zài)激光(guāng)照射下，許多(duō)熒(yíng)光染料分子(zǐ)會產(chǎn)生諸如單(dān)態氧或自由(yóu)基(jī)等(děng)細胞**，所以實驗中(zhōng)要限製掃(sǎo)描(miáo)時(shí)間(jiān)和激(jī)發光的光功(gōng)率(shuài)密度(dù)以保(bǎo)持(chí)樣品(pǐn)的活性(xìng)。在針(zhēn)對活(huó)性樣品的(dí)研(yán)究中，尤(yóu)其是(shì)活性樣品(pǐn)生長，發(fā)育(yù)過(guò)程(chéng)的(dí)各個(gè)階段，光漂(piāo)白和光(guāng)毒現象(xiàng)使(shǐ)這(zhè)些研究受到很大的限製。
 在傳統熒光顯(xiǎn)微鏡中(zhōng)，一(yī)個(gè)熒(yíng)光團吸(xī)收一個光子，該光子(zǐ)能量對應於(yú)熒光團基態(tài)和激(jī)發態能(néng)量(liáng)之差。通(tōng)過一(yī)個(gè)較短壽命(mìng)的虛態(tài)，也(yě)可(kě)以(yǐ)通(tōng)過(guò)同(tóng)時吸收兩個較(jiào)低(dī)能量（即更高的(dí)波長）的光子激(jī)發熒光。例如(rú)，吸收兩個紅色波(bō)長的光子，可(kě)以(yǐ)激(jī)發一個吸(xī)收(shōu)紫外(wài)的(dí)分子。雙光(guāng)子激(jī)發(fā)是一個非(fēi)綫性過(guò)程，對(duì)激(jī)發(fā)光強度有平(píng)方(fāng)依賴(lài)關(guān)係(xì)。
使用單(dān)激發(fā)光(guāng)源(yuán)，雙光子具有相(xiāng)同(tóng)的波長(cháng)，該(gāi)技術(shù)被稱為(wéi)雙光子(zǐ)激發(fā)熒(yíng)光(guāng)顯微(wēi)術。如(rú)果兩個光(guāng)子具有不同(tóng)的(dí)波長，就(jiù)稱作(zuò)雙色激發熒光顯微術。
雙光子吸收(shōu)幾(jī)率依(yī)賴於兩個入(rù)射(shè)光子在空間(jiān)和時間上的重合(hé)程(chéng)度（兩(liǎng)個光子(zǐ)必須在10－18秒內(nèi)到(dào)達）。雙(shuāng)光(guāng)子(zǐ)吸(xī)收截麵(miàn)很(hěn)小(xiǎo)，對若(ruò)丹(dān)明B一般為(wéi)10－50cm4 s photon－1 molecule－1，這(zhè)樣，隻(zhī)有在具有很(hěn)大光(guāng)子流量(liáng)的(dí)區(qū)域(yù)的熒(yíng)光團(tuán)才會(huì)被激發。鈦寶石激(jī)光(guāng)器(qì)等鎖模的，高(gāo)峰值功率(shuài)激(jī)光可以為雙光(guāng)子(zǐ)激(jī)發提供(gōng)足(zú)夠的強(qiáng)度。
由於(yú)激(jī)發強(qiáng)度隨到(dào)焦(jiāo)平麵的(dí)距離(lí)的平(píng)方(fāng)變化，在z軸方(fāng)向雙光子激發(fā)幾(jī)率隨(suí)離(lí)焦(jiāo)距離的(dí)四(sì)次方衰減(jiǎn)，熒(yíng)光團(tuán)激發(fā)隻(zhī)發(fā)生(shēng)在(zài)焦(jiāo)點(diǎn)內(nèi)。用數(shù)值孔(kǒng)徑為1.25的(dí)物鏡(jìng)，激(jī)發波長為780納米，全(quán)部(bù)激發熒光的80%被局(jú)限在焦平麵(miàn)1微米(mǐ)範圍(wéi)內，激發體積大約(yuē)為(wéi)0.1-1飛升(shēng)，與(yǔ)傳(chuán)統熒光顯微(wēi)鏡相比，該體積降(jiàng)低(dī)了1010倍。
在激光掃描熒(yíng)光顯(xiǎn)微(wēi)術(shù)中(zhōng)，雙光(guāng)子激(jī)發(fā)具有(yǒu)三(sān)維層析能(néng)力(lì)，該(gāi)三維層析(xī)效(xiào)果可(kě)與共焦(jiāo)顯微鏡相比(bǐ)擬，它還(huán)比(bǐ)具(jù)有另(lìng)外(wài)兩個優勢：因為(wéi)照(zhào)明光在時(shí)間空(kōng)間(jiān)上匯(huì)聚，沒有離(lí)焦(jiāo)光漂白；激(jī)發(fā)光不會被(bèi)離焦吸(xī)收衰(shuāi)減，因而有(yǒu)較大的穿透深度。
雙色激(jī)發比雙光子激發(fā)的優勢(shì)並不(bù)在於(yú)較高的(dí)分辨(biàn)率，而是在於小目標(biāo)物經(jīng)過(guò)較大(dà)散射媒質後(hòu)更(gēng)容易(yì)觀察。事實(shí)上，與雙光(guāng)子激(jī)發比(bǐ)較，雙色激發在(zài)焦(jiāo)點內(nèi)熒(yíng)光散(sàn)射(shè)增(zēng)加，而幹擾背(bèi)景熒(yíng)光隻(zhī)有很(hěn)小(xiǎo)增(zēng)加(jiā)。
    結(jié)合多光(guāng)子熒(yíng)光技術(shù)，多光(guāng)子(zǐ)共(gòng)聚(jù)焦(jiāo)顯(xiǎn)微鏡（Multiphoton Excitation－MPE）的(dí)發展成功(gōng)的(dí)解決了傳(chuán)統共聚(jù)焦顯(xiǎn)微(wēi)鏡(jìng)（單光子共(gòng)聚焦顯(xiǎn)微鏡）所存(cún)在的問題，MPE的激(jī)光(guāng)源是(shì)超快激(jī)光器（多(duō)為鈦(tài)寶(bǎo)石激光器(qì)，可(kě)以達到皮秒(miǎo)或者飛秒級的掃(sǎo)描(miáo)速度），具(jù)有(yǒu)非(fēi)常高的峰值功(gōng)率(shuài)和(hé)較(jiào)低(dī)的平均(jūn)功(gōng)率，從(cóng)而可(kě)以減(jiǎn)小(xiǎo)或者(zhě)消除(chú)光漂白和光(guāng)毒(dú)作(zuò)用(yòng)。多(duō)光(guāng)子的吸(xī)收(shōu)現象(xiàng)是(shì)非(fēi)綫(xiàn)性效應，隻發生(shēng)在聚(jù)焦焦點(diǎn)處，不需要共(gòng)聚(jù)焦(jiāo)孔徑(jìng)光闌濾光(guāng)，從(cóng)而大大提(tí)高成(chéng)像(xiàng)亮度和信(xìn)噪(zào)比(bǐ)。在傳統激光共聚(jù)焦顯(xiǎn)微鏡(jìng)中(zhōng)，光(guāng)通過出(chū)的(dí)所(suǒ)有(yǒu)樣(yàng)品都(dū)被(bèi)激發，所(suǒ)以(yǐ)必須用(yòng)孔徑光闌來(lái)選(xuǎn)取焦點處(chǔ)樣(yàng)品發(fā)出(chū)的(dí)熒(yíng)光(guāng)。孔徑(jìng)光(guāng)闌不(bù)僅(jǐn)遮擋(dǎng)了焦(jiāo)點以(yǐ)外樣(yàng)品發出的熒(yíng)光，而(ér)且也遮擋了(liǎo)焦點(diǎn)處散射和漫反(fǎn)射的(dí)熒(yíng)光。在MPE中(zhōng)，焦(jiāo)點處(chǔ)發(fā)出的(dí)所(suǒ)有熒(yíng)光，包(bāo)括散射和漫反射(shè)的熒光(guāng)都(dū)可(kě)以(yǐ)被收集並(bìng)探測到。並且由於(yú)多光子(zǐ)實(shí)驗所用的激發光的波長較長，激(jī)發(fā)光的散射損(sǔn)失(shī)很(hěn)小，軸(zhóu)向分(fēn)辨(biàn)率更高，樣品(pǐn)的穿(chuān)透(tòu)能力更強(qiáng)。